潛在緩解方法綜述

摘要

基于中國(guó)倉鼠卵巢（CHO）細(xì)胞的重組蛋白生物生產(chǎn)如今在補(bǔ)料分批培養(yǎng)中通?？蓪?shí)現(xiàn)超過5克/升的滴度。這一進(jìn)展部分歸因于CHO細(xì)胞對(duì)各種基因操作和培養(yǎng)條件變化的快速適應(yīng)性。其固有的可塑性基因組賦予了這種適應(yīng)性；然而，這也使CHO細(xì)胞具有基因組重排的傾向。結(jié)合高產(chǎn)細(xì)胞的基因組和代謝需求，CHO細(xì)胞的可塑性在生物生產(chǎn)過程中表現(xiàn)為細(xì)胞系的不穩(wěn)定性，表現(xiàn)為生產(chǎn)力和產(chǎn)品質(zhì)量的下降。在這篇綜述中，我們對(duì)滴度和質(zhì)量穩(wěn)定性進(jìn)行了定義，并討論了CHO不穩(wěn)定性現(xiàn)象的主要原因以及克隆選擇和基因操作方面的進(jìn)展。我們還討論了系統(tǒng)生物學(xué)方面的進(jìn)展，這些進(jìn)展能夠?yàn)樵缙陬A(yù)測(cè)CHO細(xì)胞的不穩(wěn)定性提供新的策略，這將有助于識(shí)別能夠維持生產(chǎn)穩(wěn)定性和可重復(fù)產(chǎn)品質(zhì)量的多克隆細(xì)胞系，即使在長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)過程中也是如此。

1.引言

自2002年以來，美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）已批準(zhǔn)316種生物治療藥物（包括生物類似藥和聯(lián)合用藥）。過去四年中，每年的新增批準(zhǔn)數(shù)量保持穩(wěn)定；截至2018年8月，本年度已有5種新藥獲批，其中包括4種單克隆抗體（依瑞魯單抗、替拉珠單抗、伊巴珠單抗、曲妥珠單抗）和1種生物類似藥促紅細(xì)胞生成素α-epbx。在2002年至今的新增批準(zhǔn)類別中，單克隆抗體（新抗體及新適應(yīng)癥）占所有新藥申請(qǐng)（NDA）和生物制品許可申請(qǐng)（BLA）批準(zhǔn)總數(shù)的22%，占2008年以來所有生物類似藥批準(zhǔn)總數(shù)的30%（圖1）。中國(guó)倉鼠卵巢（CHO）細(xì)胞系已成為生產(chǎn)重組治療藥物的首選，約70%的重組生物制藥蛋白以及2016年以來獲批的所有單克隆抗體（阿達(dá)木單抗、貝洛托珠單抗、阿維魯單抗、度普利尤單抗、德瓦魯單抗、奧瑞珠單抗、布羅達(dá)單抗）均通過CHO細(xì)胞系生產(chǎn)。研究表明，CHO細(xì)胞具有多種適合工業(yè)化生產(chǎn)的特性，如耐受基因操作、易于適應(yīng)生產(chǎn)工藝規(guī)模、生長(zhǎng)速度快，且具備進(jìn)行人類兼容型翻譯后修飾的固有能力。過去30年生物制藥研發(fā)的諸多漸進(jìn)式進(jìn)展，促成了CHO細(xì)胞培養(yǎng)工藝的建立，其補(bǔ)料分批培養(yǎng)的滴度已達(dá)13g/L。在生物類似藥興起的時(shí)代，隨著人們對(duì)蛋白質(zhì)療效的深入理解以及對(duì)法規(guī)合規(guī)性分析的重視，上游工藝開發(fā)面臨的新挑戰(zhàn)是生產(chǎn)大量電荷、分子量和療效特征一致的重組蛋白。

已有研究提出，CHO細(xì)胞系核型中觀察到的染色體重排和其他基因組變異，在一定程度上使部分細(xì)胞系具備了適應(yīng)工業(yè)化生產(chǎn)的性能。然而，正是這種基因組可塑性，導(dǎo)致培養(yǎng)過程中常出現(xiàn)一個(gè)問題：細(xì)胞在長(zhǎng)期培養(yǎng)過程中，甚至在最終生物反應(yīng)器規(guī)模培養(yǎng)的延長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)，重組蛋白產(chǎn)量可能會(huì)意外下降。已發(fā)現(xiàn)多種機(jī)制可導(dǎo)致這種不穩(wěn)定性，例如基因丟失、基因沉默以及細(xì)胞應(yīng)激敏感性增加。此外，凋亡增加、全局基因變化以及全基因組/表觀基因組變化等遠(yuǎn)端因素也可能引發(fā)生產(chǎn)不穩(wěn)定性。意外且不可預(yù)測(cè)的基因變化還可能導(dǎo)致與糖基化、蛋白質(zhì)折疊、蛋白酶和分子伴侶相關(guān)的細(xì)胞基因表達(dá)改變。同時(shí)，生物制藥生產(chǎn)過程易受溫度、pH值、滲透壓和氧傳遞等因素波動(dòng)的影響，這些變化會(huì)動(dòng)態(tài)干擾轉(zhuǎn)錄組。因此，局部轉(zhuǎn)基因和全局宿主細(xì)胞基因組的偏差可能會(huì)意外導(dǎo)致工藝產(chǎn)量下降、影響項(xiàng)目進(jìn)度、增加成本、改變蛋白質(zhì)質(zhì)量，并引發(fā)法規(guī)合規(guī)問題。研究還發(fā)現(xiàn)，所選細(xì)胞的特性往往會(huì)隨時(shí)間丟失，且來自同一細(xì)胞群體的克隆株其特性可能存在顯著差異?？傮w而言，多個(gè)實(shí)驗(yàn)室已達(dá)成共識(shí)：CHO細(xì)胞在生長(zhǎng)和表型特性方面存在異質(zhì)性，且隨著時(shí)間推移會(huì)表現(xiàn)出基因組不穩(wěn)定性。因此，生產(chǎn)過程中的穩(wěn)定性無法長(zhǎng)期保證。

本綜述擴(kuò)展了細(xì)胞系不穩(wěn)定性的現(xiàn)有定義，將產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定性納入其中（圖2）。文中列舉了文獻(xiàn)中已知的所有CHO細(xì)胞不穩(wěn)定性成因，并討論了通過這些機(jī)制克服不穩(wěn)定性的當(dāng)前研究進(jìn)展。最后，我們探討了開發(fā)新工具以加深對(duì)CHO細(xì)胞不穩(wěn)定性理解的必要性。在CHO細(xì)胞系開發(fā)領(lǐng)域，持續(xù)創(chuàng)新和采用基于系統(tǒng)的方法來識(shí)別、監(jiān)測(cè)并設(shè)計(jì)解決方案以徹底消除不穩(wěn)定性，是當(dāng)前的迫切需求。

2.細(xì)胞系穩(wěn)定性的定義

任何工業(yè)生產(chǎn)過程都必須遵循嚴(yán)格標(biāo)準(zhǔn)，以確保產(chǎn)品的可重復(fù)性、合規(guī)性和質(zhì)量。生物治療藥物生產(chǎn)過程具有獨(dú)特性，其利用培養(yǎng)中的活細(xì)胞進(jìn)行生產(chǎn)。盡管工程控制技術(shù)已相當(dāng)成熟，但生物系統(tǒng)的重復(fù)樣本仍可能出現(xiàn)預(yù)期偏差。在穩(wěn)健且監(jiān)測(cè)完善的工藝中，穩(wěn)定細(xì)胞系可定義為具有以下特征的均質(zhì)細(xì)胞群體：在70代內(nèi)保持70%或以上的體積產(chǎn)率滴度（從主細(xì)胞庫擴(kuò)大到生產(chǎn)規(guī)模通常需要60代）。

與參考產(chǎn)品相比，在結(jié)構(gòu)、功能、純度、化學(xué)特性和生物活性方面無“臨床意義上的差異”。長(zhǎng)期穩(wěn)定性研究的產(chǎn)率特征可分為以下幾類（圖3）：

理想型：在100代培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，細(xì)胞產(chǎn)率滴度的偏差不超過15%（在測(cè)量誤差范圍內(nèi)）。

穩(wěn)定型：在超過60代的培養(yǎng)中，細(xì)胞測(cè)量值的偏差在檢測(cè)方法的允許范圍內(nèi)。

漸進(jìn)丟失型：在不到60代的多次傳代過程中，細(xì)胞產(chǎn)率出現(xiàn)可測(cè)量的漸進(jìn)式下降。

立即丟失型：在少數(shù)幾代傳代內(nèi)，細(xì)胞產(chǎn)率突然急劇下降。

在典型的細(xì)胞系篩選流程中，轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞通過有限稀釋接種進(jìn)行克隆。最終篩選出的克隆株需具備高產(chǎn)率，并保持一致且可比的產(chǎn)品質(zhì)量。在明確的生產(chǎn)工藝中，細(xì)胞系對(duì)質(zhì)量屬性的影響最為顯著。事實(shí)上，培養(yǎng)物中的糖基化水平、蛋白酶表達(dá)、氨和乳酸水平均為克隆特性，對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量有重要影響。因此，有必要通過高通量檢測(cè)監(jiān)測(cè)所選優(yōu)質(zhì)克隆株的產(chǎn)品質(zhì)量屬性，如電荷分布分析和分子量分析，以確保篩選出具有理想宿主細(xì)胞特性和最佳且一致產(chǎn)品質(zhì)量的克隆株。

據(jù)估計(jì)，8%-63%的重組CHO細(xì)胞系存在產(chǎn)品滴度不穩(wěn)定性。早期生產(chǎn)不穩(wěn)定性可能歸因于表觀遺傳機(jī)制導(dǎo)致的轉(zhuǎn)基因表達(dá)丟失，而漸進(jìn)式穩(wěn)定性丟失可能與非生產(chǎn)性亞群有關(guān)。然而，不穩(wěn)定性與CHO宿主細(xì)胞的選擇（DG44與CHO-K1）、擴(kuò)增方法（谷氨酰胺合成酶（GS）篩選與二氫葉酸還原酶（DHFR）篩選）無關(guān)，且在有或無選擇壓力（如甲氨蝶呤（MTX）和蛋氨酸亞砜亞胺（MSX））的情況下均會(huì)發(fā)生；這使得該現(xiàn)象在當(dāng)前細(xì)胞系開發(fā)流程中極為普遍。目前，關(guān)于這些參數(shù)對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定性的影響，相關(guān)數(shù)據(jù)尚不充分。

3.CHO細(xì)胞不穩(wěn)定性表型的機(jī)制成因

盡管已有多種細(xì)胞系和產(chǎn)品出現(xiàn)不穩(wěn)定性問題的報(bào)道，但最終滴度下降和/或偏離設(shè)定質(zhì)量參數(shù)的現(xiàn)象仍是固有的且不可預(yù)測(cè)的。雖然CHO細(xì)胞不穩(wěn)定性的成因尚未完全闡明，但以下是一些已被較好理解的分子機(jī)制（表1）。

4.CHO基因組的固有不穩(wěn)定性

不穩(wěn)定性的根本原因部分在于CHO細(xì)胞的基因組可塑性。CHO原始細(xì)胞在帕克實(shí)驗(yàn)室被永生化并建立，隨后篩選出了生長(zhǎng)速度更快的細(xì)胞群體。這些細(xì)胞含有11對(duì)染色體。此后，通過多次隨機(jī)誘變和化學(xué)處理，生成了CHODG44和CHOK1宿主細(xì)胞。在CHO宿主細(xì)胞用于生物制造之前，可能已進(jìn)行了數(shù)百次此類傳代培養(yǎng)。除染色體異常外，長(zhǎng)期培養(yǎng)中CHO細(xì)胞因轉(zhuǎn)錄錯(cuò)誤導(dǎo)致的DNA模板突變背景率較高。這些觀察結(jié)果表明，該細(xì)胞系的DNA修復(fù)和轉(zhuǎn)錄機(jī)制可能存在缺陷。測(cè)序結(jié)果還顯示，CHO染色體的單倍體發(fā)生率較高。由于這種基因組不穩(wěn)定性，某些克隆株可能最初具備生物治療藥物生產(chǎn)所需的所有理想特性，但隨后可能出現(xiàn)基因型和表型漂移，導(dǎo)致產(chǎn)品滴度和質(zhì)量發(fā)生變化。與生產(chǎn)細(xì)胞系相比，CHO宿主細(xì)胞的不穩(wěn)定性尚未得到充分研究。由于生產(chǎn)細(xì)胞系是通過將轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞中，然后篩選穩(wěn)定表達(dá)轉(zhuǎn)基因的克隆株（或細(xì)胞池）生成的，因此宿主細(xì)胞的基因組/染色體不穩(wěn)定性可能會(huì)傳遞給生產(chǎn)細(xì)胞系。

5.基因組對(duì)產(chǎn)率丟失的影響

高拷貝數(shù)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染可導(dǎo)致重組DNA與宿主基因組整合。已知轉(zhuǎn)基因整合位點(diǎn)會(huì)影響轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。例如，在高產(chǎn)細(xì)胞中，基因插入片段常出現(xiàn)在大型染色體上，而在低產(chǎn)或不穩(wěn)定細(xì)胞中，基因整合更常發(fā)生在已知的脆性位點(diǎn)（基因組中特別容易發(fā)生DNA斷裂的區(qū)域）。

用于生成克隆株的篩選系統(tǒng)也會(huì)影響轉(zhuǎn)基因表達(dá)的穩(wěn)定性。最常用的篩選系統(tǒng)是CHO-DG44宿主細(xì)胞的MTX篩選系統(tǒng)和CHO-GS宿主細(xì)胞的MSX篩選系統(tǒng)。MTX篩選方法的原理是抑制dhfr基因。在MTX處理過程中，DNA合成途徑受到抑制，CHO細(xì)胞易發(fā)生嚴(yán)重的基因重排。

轉(zhuǎn)基因的位置和拷貝數(shù)也會(huì)影響重組基因的表達(dá)。在MTX介導(dǎo)的擴(kuò)增中，轉(zhuǎn)基因整合是隨機(jī)的，可能導(dǎo)致局部和遠(yuǎn)端出現(xiàn)多個(gè)拷貝。在多拷貝插入和顯著基因擴(kuò)增的情況下，克隆株往往會(huì)丟失這些拷貝（進(jìn)而導(dǎo)致產(chǎn)率下降）。事實(shí)上，細(xì)胞持續(xù)高水平表達(dá)重組蛋白會(huì)帶來巨大的代謝負(fù)擔(dān)。細(xì)胞擺脫這種代謝負(fù)擔(dān)的常見機(jī)制是通過自發(fā)地從宿主基因組中刪除轉(zhuǎn)基因。

即使在沒有選擇壓力的情況下，CHO細(xì)胞也可能丟失拷貝數(shù)。這種轉(zhuǎn)基因的自發(fā)丟失可能是DNA重排的結(jié)果。在擴(kuò)增程度較低的系統(tǒng)（如MSX篩選系統(tǒng)）中，也可能出現(xiàn)產(chǎn)率下降，有報(bào)道稱該系統(tǒng)中細(xì)胞克隆株的凋亡敏感性增加會(huì)導(dǎo)致基因表達(dá)丟失。

6.轉(zhuǎn)錄沉默

轉(zhuǎn)錄受多種因素影響，如DNA甲基化、核小體定位、組蛋白修飾和變異、轉(zhuǎn)錄復(fù)合物結(jié)合以及非編碼RNA的調(diào)控。這些因素可獨(dú)立或聯(lián)合作用于重組表達(dá)。此外，轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控可獨(dú)立于降低轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)的基因組因素，已有報(bào)道稱長(zhǎng)期培養(yǎng)中在未丟失轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)的情況下仍會(huì)出現(xiàn)產(chǎn)率下降。通常，強(qiáng)病毒啟動(dòng)子被用于驅(qū)動(dòng)重組蛋白的表達(dá)；然而，這些啟動(dòng)子含有富含CG的區(qū)域，易通過甲基化發(fā)生沉默。有趣的是，何等人的研究報(bào)道，使用無CpG啟動(dòng)子可減少早期轉(zhuǎn)基因沉默，但無法改善長(zhǎng)期穩(wěn)定性。事實(shí)上，已知生產(chǎn)細(xì)胞系中的組蛋白修飾模式會(huì)不斷發(fā)生改變，導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因以及細(xì)胞蛋白的基因沉默。此外，對(duì)長(zhǎng)期培養(yǎng)的抗體生產(chǎn)細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)，全局組蛋白乙?；浇档停@表明生產(chǎn)穩(wěn)定性和產(chǎn)品質(zhì)量可能受表觀基因組的影響。

7.基因組/表型漂移

從重組DNA進(jìn)入宿主細(xì)胞核進(jìn)行染色體整合，到克隆篩選，再到商業(yè)生產(chǎn)，整個(gè)過程可能需要數(shù)月時(shí)間。在此過程中，高產(chǎn)細(xì)胞系可能會(huì)表現(xiàn)出異質(zhì)性表達(dá)模式或丟失重組蛋白的表達(dá)。有報(bào)道稱，克隆篩選后，來自所選細(xì)胞池的克隆株其基因組均一性與所選單克隆株無顯著差異。然而，在細(xì)胞系開發(fā)過程中已觀察到表型漂移。多項(xiàng)研究表明，在分批或補(bǔ)料分批培養(yǎng)中，細(xì)胞遇到營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和代謝物濃度變化時(shí)，轉(zhuǎn)錄組會(huì)發(fā)生改變。在分批培養(yǎng)過程中以及生產(chǎn)周期內(nèi)，為響應(yīng)不斷變化的培養(yǎng)環(huán)境，培養(yǎng)物中多達(dá)1400種mRNA的表達(dá)會(huì)受到差異調(diào)控。李等人的其他研究表明，在不穩(wěn)定群體的長(zhǎng)期培養(yǎng)中，基因表達(dá)變化更為頻繁。值得注意的是，這些研究中的不穩(wěn)定性并非由轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)丟失或轉(zhuǎn)錄的局部表觀遺傳調(diào)控引起，而是由參與RNA轉(zhuǎn)運(yùn)、mRNA翻譯和穩(wěn)定性以及細(xì)胞周期調(diào)控的遠(yuǎn)端基因的差異調(diào)控導(dǎo)致，進(jìn)而引起克隆表型的整體改變。此外，有報(bào)道稱，經(jīng)過50代以上傳代后，膜聯(lián)蛋白V和半胱天冬酶3的過表達(dá)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)凋亡的敏感性增加，從而引發(fā)生產(chǎn)不穩(wěn)定性[24]。研究表明，經(jīng)過多次傳代后，CHO細(xì)胞會(huì)因應(yīng)激相關(guān)標(biāo)志物的過表達(dá)和細(xì)胞代謝的改變而導(dǎo)致體積產(chǎn)率下降。

值得注意的是，蛋白質(zhì)折疊和細(xì)胞應(yīng)激通路常常相互重疊。對(duì)于產(chǎn)率達(dá)到數(shù)克每升的重組細(xì)胞系，培養(yǎng)物中應(yīng)激標(biāo)志物的增加可能表明存在一定程度的產(chǎn)品錯(cuò)誤折疊和聚集。凋亡增加會(huì)導(dǎo)致蛋白水解性宿主細(xì)胞蛋白（HCP）釋放到培養(yǎng)基中。HCP會(huì)增加無活性甚至有害片段和聚集物產(chǎn)生的風(fēng)險(xiǎn)。在延長(zhǎng)的生產(chǎn)周期中，死亡細(xì)胞釋放的HCP和存活細(xì)胞分泌的HCP在細(xì)胞外的積累水平遠(yuǎn)高于分批培養(yǎng)，從而可能影響產(chǎn)品質(zhì)量。特別是，培養(yǎng)基中積累的蛋白酶和糖苷酶會(huì)對(duì)表達(dá)靶標(biāo)的質(zhì)量產(chǎn)生負(fù)面影響。除了CHO細(xì)胞在生產(chǎn)周期中的全局變化外，有報(bào)道稱特定通路（如糖基化）可能在長(zhǎng)期培養(yǎng)中被沉默。對(duì)于N-糖基化通路，在所檢測(cè)的24個(gè)基因中，有21個(gè)在補(bǔ)料分批培養(yǎng)過程中表現(xiàn)出顯著的差異調(diào)控，導(dǎo)致重組干擾素-γ的唾液酸化水平降低。

眾所周知，CHO細(xì)胞系在適應(yīng)/篩選過程中，甚至在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)過程中，經(jīng)常發(fā)生染色體重排。由于在典型的細(xì)胞系開發(fā)過程中可能發(fā)生大量的單核苷酸變異（SNV）和點(diǎn)突變，亞克隆變異以及表型漂移引起的產(chǎn)品滴度和質(zhì)量不穩(wěn)定性的根本成因和緩解方法仍是一項(xiàng)挑戰(zhàn)。

8.克服CHO細(xì)胞系不穩(wěn)定性的策略

傳統(tǒng)上，細(xì)胞系開發(fā)流程依賴于轉(zhuǎn)基因在基因組中的隨機(jī)整合。篩選/擴(kuò)增可能導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因的局部擴(kuò)增或遠(yuǎn)端擴(kuò)增。然而，這種方法缺乏可控性，可能導(dǎo)致不必要的位置效應(yīng)。此外，產(chǎn)生的多個(gè)拷貝可能會(huì)發(fā)生缺失或沉默，從而導(dǎo)致滴度不穩(wěn)定性。同時(shí)，CHO細(xì)胞的基因組重排傾向、表觀遺傳變化、轉(zhuǎn)錄沉默和蛋白質(zhì)組變化均會(huì)影響細(xì)胞系穩(wěn)定性。為克服這些問題，相關(guān)機(jī)構(gòu)會(huì)篩選和測(cè)試數(shù)百個(gè)克隆株以鑒定穩(wěn)定的克隆株。以下是一些已成功應(yīng)用于解決細(xì)胞系穩(wěn)定性問題的策略。

8.1克服CHO細(xì)胞系穩(wěn)定性的基因組障礙

為避免基因的隨機(jī)插入，目前已開發(fā)出多種利用位點(diǎn)特異性核酸酶實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因定點(diǎn)整合的方法。多個(gè)研究小組報(bào)道，這些方法具有低脫靶效應(yīng)、表達(dá)均一性好以及在多次傳代中保持穩(wěn)定表達(dá)的特點(diǎn)。如今，隨著CHO細(xì)胞詳細(xì)基因組序列的獲得，可以更精確地定制CHO細(xì)胞中的定點(diǎn)整合。

考慮到CHO細(xì)胞的誘變歷史以及主要CHO-DG44和CHO-K1宿主細(xì)胞中染色體單倍體的普遍性，工業(yè)平臺(tái)正逐漸轉(zhuǎn)向使用CHO-GS敲除細(xì)胞宿主。該細(xì)胞系通過鋅指核酸酶基因編輯技術(shù)生成，而非化學(xué)誘變。此外，該細(xì)胞系無需多步擴(kuò)增，因此在下游細(xì)胞篩選方法中，轉(zhuǎn)基因缺失和沉默的可能性降低。

未來，預(yù)測(cè)細(xì)胞系穩(wěn)定性具有重要價(jià)值。如果任何不穩(wěn)定性是由基因組重排引起的，可通過細(xì)胞核型分析檢測(cè)這些變化，并將其作為生產(chǎn)不穩(wěn)定性的標(biāo)志物和指示物。

8.2克服CHO細(xì)胞系穩(wěn)定性的轉(zhuǎn)錄障礙

轉(zhuǎn)基因沉默導(dǎo)致的產(chǎn)率下降已被廣泛報(bào)道，目前已有多項(xiàng)研究致力于提高轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。例如，已將多種調(diào)控元件整合到表達(dá)載體中以增強(qiáng)重組蛋白的表達(dá)?；|(zhì)附著區(qū)（MARs）是基因組DNA序列，在分裂間期作為DNA與核基質(zhì)結(jié)合的附著位點(diǎn)。研究表明，MARs可提高CHO細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中的轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平以及陽性克隆的比例。有報(bào)道稱，將MARs元件與強(qiáng)載體結(jié)合使用，可使成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞數(shù)量增加，產(chǎn)率提高超過12倍，且在培養(yǎng)過程中能更好地維持表達(dá)。其他一些染色體元件，如基因座控制區(qū)（LCRs）和泛染色質(zhì)開放元件（UCOEs），也被用于重組蛋白生產(chǎn)，在維持轉(zhuǎn)基因的持續(xù)轉(zhuǎn)錄和補(bǔ)料分批培養(yǎng)中的穩(wěn)定生產(chǎn)方面均取得了進(jìn)展。除載體工程外，使用合成啟動(dòng)子、無CpG啟動(dòng)子和巨細(xì)胞病毒（CMV）突變體已生成轉(zhuǎn)基因沉默傾向降低的克隆株。除了提高轉(zhuǎn)基因的產(chǎn)率外，載體元件還能使重組蛋白在多次傳代中保持穩(wěn)定表達(dá)。

8.3克服表型漂移引起的CHO細(xì)胞系穩(wěn)定性障礙

CHO細(xì)胞在工業(yè)上廣泛應(yīng)用的主要原因之一是其表型適應(yīng)性和可塑性。事實(shí)上，可通過篩選CHO細(xì)胞獲得多種截然不同的表型，如抗病毒感染和表達(dá)特定糖型。盡管取得了這些成功，但持續(xù)的表型漂移仍是一個(gè)固有問題。白克和李的一項(xiàng)研究調(diào)查了CHO-DUK細(xì)胞及其亞克隆株的染色體重排情況。結(jié)果表明，在無代謝負(fù)擔(dān)或其他選擇壓力的情況下，宿主細(xì)胞中的克隆株表現(xiàn)出核型異質(zhì)群體。這一觀察結(jié)果表明，即使在常規(guī)傳代培養(yǎng)過程中，也會(huì)發(fā)生染色體重排。由于不穩(wěn)定性是細(xì)胞活動(dòng)多種變化的結(jié)果，系統(tǒng)生物學(xué)方法將有助于更好地理解和克服穩(wěn)定性問題。改進(jìn)的中國(guó)倉鼠參考基因組的獲得將為基因組工程研究提供支持。此外，已有多項(xiàng)研究致力于確定最佳整合位點(diǎn)，以提高生成蛋白質(zhì)生產(chǎn)穩(wěn)定的細(xì)胞群體的可能性。同樣，利用改進(jìn)的基因組序列，宿主細(xì)胞工程研究可幫助去除影響產(chǎn)品質(zhì)量的蛋白酶。在最近的一項(xiàng)研究中，來自改進(jìn)基因組組裝的新信息被用于鑒定與難以去除的宿主細(xì)胞蛋白具有相似預(yù)測(cè)功能和特征的靶點(diǎn)。盡管可能存在一些益處，但在不久的將來，相關(guān)領(lǐng)域不太可能放棄使用CHO細(xì)胞。因此，當(dāng)前的需求包括理解不穩(wěn)定性的生物學(xué)機(jī)制、鑒定生物標(biāo)志物，以及在細(xì)胞系開發(fā)的早期階段納入基于生物信息學(xué)的基因組挖掘，以鑒定穩(wěn)定的克隆株。作為早期實(shí)例，研究已揭示線粒體功能在維持高產(chǎn)細(xì)胞的生物合成能力方面的重要性。這些基因和通路的鑒定可初步作為鑒定長(zhǎng)期培養(yǎng)中穩(wěn)定生產(chǎn)株特征的標(biāo)志物。

9.討論

目前，CHO細(xì)胞的產(chǎn)率已達(dá)到相當(dāng)高的水平，工藝開發(fā)的瓶頸通常在于下游加工步驟。隨著首批生物治療藥物專利到期，生物類似藥的生產(chǎn)需要更穩(wěn)定的產(chǎn)品滴度，以控制生產(chǎn)成本并確保產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定性。隨著病毒抗原、疫苗以及雙特異性和三特異性抗體（具有多個(gè)獨(dú)特結(jié)合位點(diǎn)的單克隆抗體）等新型生物分子進(jìn)入生產(chǎn)管線，產(chǎn)品質(zhì)量維持可能會(huì)優(yōu)先于進(jìn)一步提高產(chǎn)率。此外，生產(chǎn)周期的總生產(chǎn)成本分析表明，細(xì)胞培養(yǎng)工藝對(duì)總成本的影響較小。因此，有必要在細(xì)胞系開發(fā)過程中納入篩選步驟，通過鑒定穩(wěn)定性標(biāo)志物，篩選出能夠提供穩(wěn)定且一致產(chǎn)品的細(xì)胞系，且不影響交付成本。我們還認(rèn)為，加大對(duì)生產(chǎn)不穩(wěn)定性問題的研究力度，將有助于理解導(dǎo)致不穩(wěn)定性的所有途徑。重組轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)丟失、轉(zhuǎn)基因沉默和整體表型漂移只是與這一復(fù)雜現(xiàn)象相關(guān)的部分因素。預(yù)測(cè)細(xì)胞系穩(wěn)定性，并最終設(shè)計(jì)細(xì)胞系工程策略以預(yù)防不穩(wěn)定性，是非常令人興奮的研究方向，且隨著該領(lǐng)域向集成連續(xù)生物加工方法的發(fā)展，這可能是必要的步驟。